知己知彼，方能百戰(zhàn)不殆。做細胞轉(zhuǎn)染也一樣道理。細胞轉(zhuǎn)染實驗的影響因素很多，如需要轉(zhuǎn)染的細胞類型(對于困難的細胞系尤其如此)，需要被轉(zhuǎn)染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì))，轉(zhuǎn)染試劑等。但無論在何種情況下，以下八個要素都不容忽視。
要素一：細胞
分裂細胞相比較非分裂細胞——分裂細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細胞都在轉(zhuǎn)染當天或前**種板。同樣重要的是細胞在種板進行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài);此外，還常用促有絲分裂刺激物(如，病毒轉(zhuǎn)化，生長因子，條件培養(yǎng)基，以及滋養(yǎng)細胞)來活化原代培養(yǎng)細胞。
貼壁細胞相比較懸浮細胞——在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細胞和懸浮細胞之間的差異顯著。相對于貼壁細胞(如HEK，CHO)，懸浮細胞(如HL 60，Jurkat)非常難以轉(zhuǎn)染，可能是因為細胞間膜結(jié)構(gòu)的差異，但目前還沒有分子水平上合理機制的解釋。
分板方案——在對培養(yǎng)細胞進行分板傳代培養(yǎng)之前，必須把貼壁細胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個常規(guī)操作可導致正常細胞功能受到嚴重損害。因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化時間的長短，胰蛋白酶的滅活等)需要優(yōu)化。
傳代次數(shù)——傳代次數(shù)是指對一個細胞系進行分批傳代的頻度(通常在一個實驗室范圍內(nèi))。某些細胞系相比較其他細胞系而言較不穩(wěn)定，可能會隨著培養(yǎng)時間的延長而改變，視不同的細胞系和培養(yǎng)條件而定。因此名稱相同的同一細胞系在生理學和形態(tài)學(以及轉(zhuǎn)染能力)性質(zhì)也可能會有很大的差異。一般而言，細胞在凍存復蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們完全復蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。
細胞數(shù)量(融合率)——只要培養(yǎng)基質(zhì)(組織培養(yǎng)皿)尚有空間，細胞就會按指數(shù)規(guī)律分裂。對于正常細胞而言，細胞生長的速度受細胞密度大小的抑制(接觸抑制)，但癌細胞則不受此限制而會繼續(xù)生長并可互相疊加。營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會影響所有的細胞生長。細胞會因受到營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染。報告基因的表達率與轉(zhuǎn)染開始時的細胞數(shù)量和細胞健康以及細胞溶解之前的生長情況相關(guān)。
培養(yǎng)物污染——培養(yǎng)物可被**、酵母、**、病毒、支原體、甚至其他細胞種類所污染。各種污染都會導致產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。
支原體污染——支原體污染在所有培養(yǎng)細胞中的比例為5-35%，它可改變細胞生長特性，酶的作用途徑，細胞膜的組成，染色體結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)染效率。特別是，支原體對采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾，其結(jié)果致使非典型轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染效率偏低。這些影響會導致實驗結(jié)果的不可靠以及時間和珍貴細胞系的損失。和**及**不同，支原體污染無法通過視覺檢查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過大多數(shù)的無菌濾膜;它們還對常用***有抗藥性。所以必需進行支原體污染的常規(guī)篩查。
要素二：載體DNA
一般原則：對純化所得的載體進行質(zhì)量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細胞體系。在測定細胞體系的參數(shù)時，一定要選用一種已知具有功能的載體做對照。
載體的完整性——載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋斷裂、核酸酶的降解，以及來自于儲存和處理過程中的物理壓力的影響。
載體制備物——各種載體是按照不同的方案在**體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物(如CsCl，內(nèi)**)可能會影響轉(zhuǎn)染效率。
載體構(gòu)造(啟動子/增強子/ORI)—轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強病毒調(diào)節(jié)元件(如，RSV，CMV，和SV40)的對照載體進行優(yōu)化和比較。然而，病毒啟動子/增強子體系的相對有效性在不同細胞系間的差異可大到兩個數(shù)量級。例如，在某些細胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴增，SV40體系可高效表達large T抗原(如，COS);而在其他許多細胞系中，則是CMV啟動子更為有效。
除此之外，各種CMV載體的表達率也會有超過一個數(shù)量級的差異，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的。
要素三：組織培養(yǎng)試劑
一般原則：優(yōu)化您的細胞生長條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并盡可能減少所用試劑的變更。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基——培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸，葡萄糖)，維生素，無機鹽，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果在使用時不是新鮮，加入就可能會產(chǎn)生問題。配置時要使培養(yǎng)基務(wù)必避光保存;因為已知有一些組分和緩沖物質(zhì)，如HEPES，當暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)。
胎牛血清——血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長促進因子和生長抑制因子的極為復雜的混和物。采集血清所用動物的年齡、營養(yǎng)水平和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量，從而引起顯著生物學變化。
添加劑——某些細胞的生長依賴于一些對生命力或細胞分裂必不可少的物質(zhì)(如，生長因子，微量元素，必需代謝物和蛋白等)。
CO2培養(yǎng)箱——細胞生長所需環(huán)境為37℃、相對濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值，細胞生理對pH的變化非常敏感，因此多數(shù)細胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2 濃度為5%來有效控制pH值，而另一些則需要10%的CO2。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對一下適當?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致(溫度、濕度和CO2)則會導致實驗結(jié)果的板間變異。來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學物質(zhì)，或**/細胞的污染也都可能影響到細胞生理。
要素四：使用瞬時轉(zhuǎn)染來生產(chǎn)蛋白瞬時轉(zhuǎn)染表達蛋白
以往為了獲得蛋白質(zhì)的高表達產(chǎn)量，必須先轉(zhuǎn)染細胞，然后挑選一個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞系進行蛋白的擴增和富集。而挑選這樣一個細胞系往往需要花費數(shù)周甚至數(shù)月的時間，這既可能是由于試劑的細胞毒性也可能是由于轉(zhuǎn)染的低效率。如果是因為轉(zhuǎn)染試劑具有細胞毒性，那么只有少數(shù)細胞能夠存活，從而導致蛋白質(zhì)的產(chǎn)量很低。而如果是因為轉(zhuǎn)染成功的細胞太少，那么那些未轉(zhuǎn)染的細胞生長速度大大超過轉(zhuǎn)染成功的細胞，其結(jié)果同樣也只能產(chǎn)生少量的目標蛋白。使用一種溫和的可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)細胞的轉(zhuǎn)染試劑，就可獲得蛋白質(zhì)的高表達。
現(xiàn)將一些影響蛋白高效表達的關(guān)鍵因素分列如下：
細胞系(有些類型的細胞比其他細胞產(chǎn)量高)
質(zhì)粒骨架(例如：增強子，啟動子，轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件)
目的蛋白(有些蛋白很難獲得高表達量)
目的蛋白的cDNA序列(例如：密碼子的優(yōu)化)
培養(yǎng)條件(營養(yǎng)物，代謝廢物，轉(zhuǎn)染抑制物)
當這些因素都得到優(yōu)化，并加入合適配比和數(shù)量的轉(zhuǎn)染復合物(轉(zhuǎn)染試劑-質(zhì)粒)后，就可獲得至少達到平均表達水平的穩(wěn)定表達克隆。
要素五：瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
制備一種穩(wěn)定細胞系的**步是選擇一種同時含有選擇性標記物和目的基因的載體。選擇性標記物通常是可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)或者酶來幫助細胞在某些毒性物質(zhì)存在下存活的基因。
一旦選好了質(zhì)粒載體，無論瞬時或者穩(wěn)定表達都采用一樣的轉(zhuǎn)染方法。在加入選擇性試劑之前，被轉(zhuǎn)染的細胞至少要在標準培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。這樣就使細胞有時間表達足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用。細胞于是在加有選擇性試劑的培養(yǎng)基中生長。那些未成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞即被殺死。而只有那些成功轉(zhuǎn)染的細胞能夠生長。有的時候，還可以將選擇性試劑持續(xù)加入到培養(yǎng)基中，以維持對細胞的選擇壓力。
要素六：轉(zhuǎn)染方案
一般原則：建立一套適當?shù)霓D(zhuǎn)染方案;首先從一種標準方案開始，然后通過改變試劑/DNA的配比和復合物的劑量進行優(yōu)化。
轉(zhuǎn)染復合物的制備——諸如轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比，離子強度，緩沖液pH值，以及溫度等變量都會影響到轉(zhuǎn)染復合物的組成和功能。質(zhì)?？捎脽o菌水或TE緩沖液稀釋。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑，就應(yīng)當仔細閱讀該試劑所提供的使用說明。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復合物;如果制備復合物所使用的培養(yǎng)基含有血清，它就會對轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制。制備轉(zhuǎn)染復合物的*佳孵育時間是一個非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大。
轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比(負載比)——所有的轉(zhuǎn)染試劑都會在某一個試劑/DNA配比時*為有效。有時候這種*佳配比的所在范圍非常狹窄;而且對于每種實驗體系都必須進行優(yōu)化才能得到*佳配比。
形成轉(zhuǎn)染復合物所用的稀釋劑——對于多數(shù)試劑而言，很關(guān)鍵的一點是要使轉(zhuǎn)染復合物能在普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基或鹽溶液中形成。
轉(zhuǎn)染復合物的加入——有兩種替換方法可用來將轉(zhuǎn)染復合物加入轉(zhuǎn)染細胞：1.將復合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基，或者2.將轉(zhuǎn)染復合物先用培養(yǎng)基稀釋，然后進行培養(yǎng)基更換操作。**種方法更簡便，而**種方法則更因為避免了試劑在局部濃聚而產(chǎn)生毒性，所以會使結(jié)果的一致性更好。
要素七：時間進度
一般原則提示：要確保*終結(jié)果的成功;建立一個合適的時間進度進行轉(zhuǎn)染實驗以保證您所需要的目的蛋白能得到*佳表達。
轉(zhuǎn)染的開始——在轉(zhuǎn)染前12小時，將細胞分種于培養(yǎng)板中。在細胞達到50-80%的融合率時開始轉(zhuǎn)染，這樣就可以使它們在實驗結(jié)束時達到接近100%的融合。細胞對轉(zhuǎn)染復合物的攝取通常在0.5-6小時的時間內(nèi)完成。在這段時間后，就不會再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所增長。
培養(yǎng)基更換——某些轉(zhuǎn)染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基。如果轉(zhuǎn)染必須在沒有胎牛血清存在的條件下進行，那么這一步驟就必不??少。而對于可在血清存在的情況下使用的無毒性轉(zhuǎn)染試劑時，如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達階段，就可以省略這一步。如果將轉(zhuǎn)染復合物留在培養(yǎng)基中直到進行檢測，那么對有些細胞系而言轉(zhuǎn)染效率會有所提高，而另外一些細胞在轉(zhuǎn)染開始幾個小時之后其轉(zhuǎn)染效率就不會再有升高。雖然在轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)染試劑/DNA復合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中**，但在此后的長期生長階段換用新鮮的培養(yǎng)基卻是必須的。如果轉(zhuǎn)染細胞需要生長3-7天，換培養(yǎng)基就尤其重要，這樣一來就使它們有時間達到*高的蛋白表達量。
時間測定——轉(zhuǎn)染開始后的24-48小時內(nèi)，報告基因產(chǎn)物的濃度逐漸增加;而這種增加取決于增強子的強度、表達外源蛋白中所涉及的細胞反應(yīng)，存活細胞的健康狀態(tài)，以及營養(yǎng)因素等。在轉(zhuǎn)染后等待3-7天收集蛋白進行純化較為常見了。
*后就是平時可能會忽略的轉(zhuǎn)染試劑本身的脫靶效應(yīng)off-target effect，轉(zhuǎn)染試劑本身對基因表達水平(高表達或低表達)的影響，有時候可能會造成假陽性的結(jié)果。
我自己的體會是，一般的細胞，用脂質(zhì)體2000和fugeneHD轉(zhuǎn)染效率相差不大，雖然*近有文獻說脂質(zhì)體2000脫靶效應(yīng)很高，但國內(nèi)在乎的人貌似不多;但是干細胞，原代細胞和腫瘤細胞等一些比較難轉(zhuǎn)的細胞系，F(xiàn)ugene HD比較溫和，細胞毒性很低，轉(zhuǎn)染效率明顯要好;懸浮細胞，各有千秋，不敢說一定可以，重在嘗試，要是都不行，就電轉(zhuǎn)吧。
要素八：交叉污染
如果同一個實驗室同時培養(yǎng)不同種類的細胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循*嚴格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。如有許多細胞系被HeLa細胞所污染。和其他細胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長快速的細胞摻入到培養(yǎng)細胞種，幾個月過后它們就會完全取代目標培養(yǎng)物。
公安機關(guān)備案號：
