1．首先以雙抗體之一于碳酸鹽緩沖液中4℃下過夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗體，洗滌去除未與固相結合或結合不緊的抗體后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結合的部分及雜質。

   2．加入含待測物的臨床樣本如血清等，溫育一定時間后洗板；此時，待測抗原就會與固相上特異抗體反應而吸附于固相上。

   3．加入酶標記的雙抗體之二，溫育一定時間后洗板；此時，在固相上即形成雙抗體與特異抗原的夾心產物。

    4．加入酶底物，溫育顯色測定(圖2—1)。

 

   在該測定模式中，有兩步溫育和板孔洗滌步驟，如果將上述測定步驟2和3并為一步，即將待測樣本和酶標抗體同時加入，從而僅有一步溫育和洗板過程，即為通常所說的“一步法”。*初的雙抗夾心ELISA試劑盒，均采用兩步法。后來，人們為了節省時間，簡化操作步驟，試劑生產廠家逐步推出了“一步法”試劑盒。目前在我們的臨床實驗室中，測定大分子抗原如HBsAg、。FP和hCG等，基本上都采用一步法。一步法相比于兩步法，雖然操作簡單‘但有其固有的缺陷，處理不好，對ELISA測定結果有嚴重影響。

   在通常的兩步溫育洗滌方法中，抗原抗體反應將遵循下述規律，即在**步中加入的待測標本中抗原(Ag)濃度逐步增加時，將使固相抗體(Ab)與抗原的結合逐步達到飽和[(1)式]，這樣當隨后加入一定濃度的酶標抗體(Ab’)后，a復合物的形成將直接與在**步中形成的b復合物相關[(2)式]，因此，待測抗原濃度的逐步增加導致了顯色的逐步加深，當抗原濃度增加到一定程度時，反應顯色達到平臺，而呈S形變化曲線(圖2—2)。

   而一步法雙抗夾心ELISA的反應曲線則為鐘形曲線(圖2—3)。也就是說測定顯色隨著待則標本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后，測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色，即所謂的“鉤狀效應”(hookeHect)，也就是我們在**沉淀試驗中所稱的“帶現象”(zonephen。menon)。一步法的反應平衡式如(3)式

    此外，b和c復合物的增加亦使得“雙抗體夾心復合物”難以形成。但如果 固相單抗和標記單抗采用針對抗原的不同且空間距離較遠的決定簇的抗體，即包被使用一種 單抗，酶標記使用另一種單抗，同時充分混勻反應液，并適當延長反應溫育時間，則可使b，。和 d復合物減少至*低程度，而大大減輕“鉤狀效應”。

   我們曾使用本室能得到的含*高濃度(約2mg／m1)HBsAg的血清樣本對目前國內較大的試劑生產廠家的“一步法”HBsAg測定ELISA試劑盒的“鉤狀效應”進行了評價，盡管大部分有在HBsAg*高濃度下的測定顯色較次高濃度(1：lo稀釋)顯色要淺的現象，但均未出現該份樣本測定為陰性的情況。盡管如此，在臨床實際工作中，仍有可能遇到“鉤狀效應”較嚴重的HBsAg測定ELISA試劑盒，我們也經常聽到基層實驗室同行在這方面的反映。因此，大家還應該重視這方面的問題·，當發現測定結果明顯與臨床不符或與相關測定指標互有矛盾，如HBeAg陽性樣本HBsAg測定為陰性時，就應考慮HBsAg測定可能存在的“鉤狀效應”問題。

   綜上所述，一步法ELISA試劑盒作為迎合臨床實驗室簡便快速要求的產物，有著巨大的市場，其雖有潛在缺陷，易導致含高濃度待測物的標本檢測為陰性(假陰性)，但精心的實驗設計，對包被和酶標記抗體仔細選擇，完全可以將“鉤狀效應”出現的可能性降至*低。此外，建議生產HBsAg，aFP和hCGELISA"一步法”測定試劑盒的廠家，應對所產的試劑在出廠前對其“鉤狀效應"(hookeffect)進行充分的研究，并提醒用戶在使用時應注意之處。

   雙抗體夾心法測抗原另一個所需要注意的是類風濕因子(RF)的干擾。我們知道，RF是一種抗變性IgG的自身抗體，主要為19S的IgM類抗體，也可見7S的IgG及IgA類抗體。這種自身抗體的特性是其是能與多種動物的變性IgG的Fc部分結合。因此，如果血清標本中含有RF，在雙抗夾心ELISA檢測時，其即可作為固相抗體和酶標抗體(均為IgG)之間的橋接抗原，而產生假陽性反應。因此，如果使用抗體的Fab2：或Fab片段作為酶標記用抗體，則可避免RF的干擾。