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單克隆抗體的融合過程
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單克隆抗體融合的方法很多,常用的有轉動法和離心法。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1*為常用。
1.試劑與材料
(1)供融合用的脾細胞及骨髓瘤細胞。
(2)1640培養液100ml。
(3)完全1640液100ml。
(4)2.5%FCS-1640液50ml。
(5)HAT培養液100ml。
(6)50%PEG:取分子量4000,高純度的(日本進口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高壓**,使用前用預熱于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合,以酚紅檢查pH,一般不必調pH。如pH有改變,可用HCl或NaHCO3調整。
(7)10ml和50ml的**沉淀管或瓶。
(8)40孔塑料培養盤。
2.操作方法
?、艤蕚浜闷⒓毎?
⑵在50ml沉淀管中混合108脾細胞和107小鼠骨髓瘤細胞,并加入50ml2.5%FCS-1640液。
?、鞘覝?00g離心3min,使細胞沉淀。
⑷移去上清液。
⑸輕敲管底部,使沉淀流動,把沉淀管放于40℃水浴中,使其達融合溫度。
?、始宇A熱至40℃的50%PEG0.8ml,用1ml吸管緩慢滴加,邊加邊搖沉淀管,肉眼觀察可見有顆粒出現,滴加過程要求持續2min。
?、思?ml1640液,邊加邊搖動,持續1min。
⑻重復⑺一次。
⑼加1ml1640液,邊加邊搖動,持續0.5min。
?、沃貜廷鸵淮?。
?、霞?640液15ml。
?、惺覝?,400g離心1min,使細胞沉淀。
?、讶ド锨?,輕敲管底部,加25ml含有HAT的完全1640液。
?、彝延谇耙蝗辗N有飼養細胞的40孔塑料培養盤中滴加融合的細胞液,每孔1滴(約0.05ml)。
?、虞p搖后,放入5%CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。
⒃第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養液。注意輕輕吸取上清液,勿將固定于孔底的細胞吸出,根據需要加入適量的飼養細胞。
?、沼诘?2、15日加入含有HAT的完全1640培養液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察,大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細胞生長出來。大多數雜交瘤細胞在10~20天內出現,但也有在1個月左右才能出現的。雜交瘤細胞出現后,吸取上清液,檢查抗體。
⒅對繼續生長的雜交瘤細胞進行增殖傳代。在傳代過程中,依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS-1640液。同時保存于液氮和進行克隆化,在這期間每代都要檢查抗體,以防止產生抗體細胞的變異和丟失。
?。ㄈ┘毎诤系年P鍵
1.技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如,供者**細胞沒有查到**應答。這必然要失敗的。
2.融合試驗*大的失敗原因是污染,融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境,以及適宜的無菌操作技術。
上海藍基生物科技有限公司
http://www.bioboke.com/
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