2021年6月24日訊/生物谷BIOON/---哺乳動物中的X染色體失活(XCI)使得XX雌性相對于XY雄性的X連鎖基因表達水平相等。XCI過程由非編碼RNA Xist(X 染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄物)控制,它在需要失活的X染色體中表達,在那里順式積累并招募基于染色質(zhì)的基因沉默所需的因子。順式限制在單個染色體區(qū)域的分子基礎尚不清楚,但人們認為這涉及特定的Xist RNA結(jié)合蛋白(例如CIZ1和SPEN)與核蛋白支架之間的相互作用。
為了更好地了解Xist RNA的獨特和不尋常的行為,來自英國牛津大學的研究人員在一項新的研究中,開發(fā)出RNA-SPLIT(sequential pulse localization imaging over time, 時間序列脈沖定位成像):一種在經(jīng)歷XCI的細胞中對單個Xist分子進行時間分辨成像的方法。他們利用BglG/Bgl莖環(huán)系統(tǒng)來標記特定的RNA和一種BglG-HaloTag融合蛋白。在活細胞(用多西環(huán)素誘導的Xist RNA進行改造的小鼠XX胚胎干細胞)中用不同的熒光HaloTag配體連續(xù)脈沖,使得他們能夠使用超分辨率三維結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(3D-SIM)對單一Xist RNA分子進行時間分辨率成像。相關(guān)研究結(jié)果近期發(fā)表在Science期刊上,論文標題為“Time-resolved structured illumination microscopy reveals key principles of Xist RNA spreading”。
與以前的工作一致,這些作者觀察到每個細胞中由大約50到100個Xist分子組成的區(qū)域(下稱Xist區(qū)域)。他們確定了誘導后1.5至5小時的時間窗口,在此期間,他們可以定量確定Xist分子在Xist區(qū)域內(nèi)的逐漸增加,被稱為擴展階段(expansion phase)。一個較晚的時間點(誘導后24小時)被作為穩(wěn)態(tài)下Xist RNA行為的代表。RNA-SPLIT的應用使他們能夠測量這兩種階段中Xist RNA動態(tài)的關(guān)鍵參數(shù)。在擴張期和穩(wěn)定期,Xist分子分別大約每2或4小時周轉(zhuǎn)一次。通過多西環(huán)素沖刷抑制Xist轉(zhuǎn)錄,導致Xist RNA穩(wěn)定性明顯增加,這表明存在一種反饋機制來平衡轉(zhuǎn)錄和周轉(zhuǎn)率。他們觀察到在擴展階段Xist RNA區(qū)域的徑向逐漸擴大,估計速度為每小時8立方微米。徑向擴大在穩(wěn)定狀態(tài)下并不明顯,這表明一旦建立了X染色體失活,Xist RNA分子就會以一種更隨機的方式定位。RNA-SPLIT進一步顯示,新合成的Xist分子主要定位于存在事先合成的Xist分子的位點---他們稱之為耦合(coupling)。
這些作者擴展了他們的分析,以探究剔除CIZ1和SPEN的影響,這兩個因子與Xist RNA的定位和順式限制有關(guān)系。CIZ1的功能喪失導致Xist RNA在分化的細胞中廣泛地散布于細胞核,這會增加Xist RNA的轉(zhuǎn)錄水平和穩(wěn)定性。盡管Xist RNA廣泛散布于細胞核,但之前合成和新合成的Xist分子的耦合仍然保留。SPEN的功能喪失導致了Xist RNA長距離定位存在重大缺陷,降低了Xist RNA的穩(wěn)定性,并破壞了Xist RNA的耦合。SPEN在Xist RNA行為中的功能與它在XCI中基于染色質(zhì)的基因沉默中的功能在遺傳上是可分離的。
綜上所述,RNA-SPLIT的開發(fā)使得XCI建立過程中單個Xist分子的空間定量分析成為可能。這種方法的應用揭示了Xist RNA行為(包括對Xist周轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)錄的反饋控制、Xist RNA擴散的動力學以及之前合成和新合成的Xist分子的耦合)的基本原則。除了這些見解之外,RNA-SPLIT還促進了人們對CIZ1和SPEN因子如何影響Xist RNA行為和定位的不同方面的理解。(生物谷 Bioon.com)