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**組織化學(xué)抗體的稀釋度、滴加與操存
《一》實驗計劃
每次實驗前應(yīng)列出詳細(xì)實驗計劃,其中包括實驗?zāi)康摹M用方法、所用一抗和二抗的種類和效價、預(yù)實施的操作流程方案以及預(yù)期實驗結(jié)果等。實驗分組編號用玻璃筆標(biāo)記在玻片上,對每一抗體均應(yīng)配以陽性和陰性對照。
《二》抗體的稀釋度
抗體稀釋度,即抗體濃度。組織中抗原的**染色是通過適宜的抗體溶液系統(tǒng)而得以定性和定位,因而抗原與抗體濃度的比例十分重要。*佳的抗體稀釋度可提高染色質(zhì)量,與周圍組織或細(xì)胞形成良好的染色對比。如果抗體濃度過高,反而減少抗體與抗原的結(jié)合,甚至導(dǎo)致假陰性結(jié)果,故各實驗室每當(dāng)使用一種新抗體時,必須試用多種稀釋度,從中確定*佳工作濃度,以防假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。由于標(biāo)本的固定、切片種類、稀釋液種類和濕盒等具體條件均可影響稀釋度,故在測試之前必須使這些條件穩(wěn)定。稀釋度應(yīng)選擇陽性反應(yīng)著色*強(qiáng)、背景著色*弱的滴度。
不同濃度BMP4對ChAT陽性**反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的影響
目前,許多實驗室常用濃縮型一抗,使用前稀釋成工作濃度的稀釋方法見。由于市售的常用二抗,即生物素化IgG,一般由試劑公司配成即用型,并裝入**組織化學(xué)試劑盒內(nèi),故不必測試二抗工作濃度。
確定一抗*佳工作濃度方法
從中可以看出,在一抗稀釋度1:100和1:200之間可找出*佳稀釋度。
《三)滴加抗體注意事項
切片在血清封閉后,傾去多余血清,便可滴加**抗體。滴加前取出玻片,用吸水紙拭去組織周圍的液體,組織與細(xì)胞表面的液體要用濾紙條輕輕吸掉,但注意勿使組織干燥,盡快滴加抗體工作液1滴(約50ul)于組織表面。由于切片周圍無液體,滴加的抗體成為一個液滴,這樣既可節(jié)省抗體,又可增加抗原與抗體結(jié)合的機(jī)會。如果玻片上是培養(yǎng)細(xì)胞,應(yīng)在鏡下選擇一個理想的區(qū)域用**組織化學(xué)油筆在此區(qū)域外圍畫一圓圈,再滴加抗體,爾后應(yīng)輕輕搖動切片數(shù)秒,以促進(jìn)抗體與組織待測抗原的結(jié)合,避免假陰性小區(qū)的出現(xiàn)。這一操作過程雖然簡單,卻十分重要。加抗體時切忌加樣器或吸頭碰到組織或細(xì)胞,以免造成破損。
《四》抗體的操存
1.抗體分裝購人的濃縮型抗體,為避免反復(fù)凍融而失效,一般需要分裝在多個安瓿中,根據(jù)需要量,每安瓿含10一20rA。除留一支現(xiàn)用,其余應(yīng)立即放置低溫冰箱內(nèi)貯存(-20℃以下)。用時取一支。以免長期保存在4℃冰箱內(nèi)失效。
2.抗體稀釋一般按其工作濃度稀釋,如1:100、1:1000等,然后用旋渦器混勻液體。剩余的抗體可保存在斗℃冰箱內(nèi).盡量在1—2個月內(nèi)用完,而不要放在0℃以下。否則抗體會很快結(jié)冰,反復(fù)凍融可使抗體效價急劇下降。對于抗體的稀釋液,在夏天溫度很高時,*好加入少許防腐劑如疊氮鈉或柳硫汞等,以免在切片上作用時間超過10小時而生**。
3.無菌與**保持使用中的抗體無菌是困難的,但是與抗體接觸的工具如滴管、吸管、試管、安瓿以及加樣器等*好經(jīng)過**,盡量減少污染的機(jī)會.否則抗體極易污染**與**,從而迅速發(fā)生渾濁沉淀而失效。
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